常规污水生物脱氮工艺可通过硝化作用和反硝化作用去除废水中的氨氮，但处理高氨氮或低碳氮比废水时存在运行成本高、效率低等问题。厌氧氨氧化(Anammox)是在厌氧条件下，厌氧氨氧化菌(AnAOB)以水中氨氮为电子供体，亚硝酸氮为电子受体，生成氮气和少量硝酸氮的生物反应。相比传统脱氮工艺，Anammox工艺无需氧气和外加有机碳源，剩余污泥产生量少，运行费用可节省90%。以Anammox为基础的新型污水脱氮工艺受到研究者的广泛关注。然而AnAOB生长代谢极其缓慢，世代时间长达11d，且环境敏感度高，使得Anammox工艺启动周期冗长。此外，AnAOB稀缺且难以培养，制约了Anammox工艺大规模应用。
有研究表明，储存后的污泥经活化后可快速启动Anammox工艺。Anammox污泥的储存可有效保留AnAOB。接种已储存污泥既有助于Anammox工艺的快速启动，又可避免AnAOB培养困难等问题。因此，储存的Anammox污泥可成为Anammox工艺的可靠菌种>
常温储存Anammox污泥可大大减少储存过程的能耗，储存污泥的激活还可缩短Anammox工艺启动时间，提高工艺启动有效性。考虑到低温或超低温储存能耗较大，本研究在常温(20℃)条件下储存Anammox污泥并激活，以期为Anammox工艺工程化应用和技术推广提供一定理论依据。
一、材料与方法
1.1 污泥储存方法
Anammox污泥取自运行9个月的Anammox固定床反应器(FBR)。用蒸馏水洗涤Anammox污泥，沉淀后撇去上层清液，重复操作3次。然后将700mL污泥转移到2L填充蜂窝状填料的广口瓶中，通过填料分散Anammox污泥，减少污泥堆积密度。填料填充比(体积比)为50%。广口瓶经氮气曝气15min以排除溶解氧，用橡皮塞密封保证厌氧环境，置于恒温控制室中。Anammox污泥在常温(20℃)下避光储存1个月，储存过程不补充营养液。
1.2 实验方法
Anammox激活采用连续流FBR，其结构见图1。
Anammox反应器呈圆柱形，由有机钢化玻璃制成，有效体积为2.6L，配有水浴夹层。恒温水箱中的热水经过水浴夹层循环使反应器温度保持在35℃。进料容器与反应器密封以保持厌氧条件。反应器以黑布包裹，保护厌氧氨氧化菌生长免受光的干扰。
将广口瓶中的Anammox储存污泥连同蜂窝状聚乙烯填料一起投加到反应器中。该填料平均密度为1100g/L，外形近似圆柱，内径25mm，高12mm，中心至外圆有3层圆，周边均为锯齿状，内部由19个大小近似的孔结构组成，具有较高的比表面积，单位体积填料表面的微生物附着量较高。同时，其多孔结构也有利于厌氧氨氧化反应产生氮气的排出。附着在填料表面生长的厌氧氨氧化菌以生物膜形式存在，产气的冲刷过程可避免生物膜生长过厚，既有利于底物传质，又使微生物处于高活性的生长阶段。
根据Anammox培养基制备模拟废水，主要成分为(NH4)2SO4和NaNO2，其余组成按表1、表2进行配比。定期更换模拟废水，避免因生物活性或其他因素改变配水组成。储存污泥激活方式院反应器温度控制在32℃，pH保持7.8~8.0，DO控制在0.05mg/L以下，模拟废水中的NH4+-N、NO2--N初始质量浓度均为50mg/L，水力停留时间为1d。根据反应器的脱氮性能，逐步提高进水NH4+-N和NO2--N至200mg/L，从而逐步提高储存污泥的Anammox活性。
1.3 分析方法
采用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)技术测定Anammox污泥中的细菌和AnAOB的细胞密度，表征Anammox储存污泥中AnAOB的存活情况。RT-PCR采用AnAOB特征引物AMX809FAMX1066R和细菌通用特征引物Eub341F-Eub534R。根据A.Dapena鄄Mora等的研究，采用批示试验测定Anammox活性。氨氮采用纳氏分光光度法(Spectrum722E型可见分光光度计)测定曰亚硝酸盐氮采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法(Spectrum722E型可见分光光度计)测定曰硝酸盐氮用紫外分光光度计法(UV-1700型紫外分光光度计)测定。pH和DO分别用便携式pH测试仪(德国SartoriusAG)和Model55溶解氧测试仪(美国YSI)测定。混合液的悬浮固体质量浓度(MLSS)、混合液挥发性悬浮固体质量浓度(MLVSS)用称重法测定。
二、结果与分析
2.1 污泥储存前后的细胞数目变化
在常温(20℃)条件下储存污泥，储存时间1个月。通过蜂窝状填料分散储存污泥，减少污泥堆积密度，减缓储存期间细胞自溶及自溶过程对污泥的不利影响。储存期间不添加任何营养物质，只维持温度平衡。分别从储存前(储存第1天)和储存后(储存第30天)的Anammox污泥中取0.5g样品，进行RTPCR测定污泥样品的细菌细胞密度和AnAOB细胞密度，结果见表3。
从表3可以看出，细菌细胞密度从3.635×10 11mL-1减少到3.012×1011mL-1，细菌总数未大量减少。为减少自身能量消耗，大多数细菌处于休眠状态以维持生存。而AnAOB细胞密度从2.338×10 11mL-1减少到1.223×10 11mL-1，数量减少近1/2，其占细菌总数的比例也由64.32%减至40.60%，这可能是由于部分AnAOB发生了自溶。但仍有相当一部分AnAOB保存下来，且储存污泥发黑发臭现象并不明显。表明在储存过程中，蜂窝状填料分散了Anammox污泥，减少了污泥堆积密度，在一定程度上可减缓自溶过程，且自溶现象只影响局部，对整体影响较小。储存后的污泥中AnAOB占细菌总数比例为40.60%，虽然有所减少，但与普通活性污泥相比仍处于较高水平。储存污泥中较高含量的土著AnAOB有利于Anammox储存污泥的激活及Anammox工艺的启动。
2.2 Anammox储存污泥激活
Anammox污泥在常温(20℃)下储存1个月后作为接种污泥启动装置，进行激活。实验分2个阶段院启动阶段和负荷提高阶段，通过NH4+-N和NO2--N的进水浓度加以区分。第1耀15天为启动阶段，用恒定的低浓度底物(NH4+-N和NO2--N均为50mg/L)对储存污泥进行激活，出水NH4+-N和NO2--N逐渐降低，并有NO3--N生成，标志Anammox成功启动曰第16耀55天为负荷提高阶段，开始提高进水浓度，增设浓度梯度，此阶段主要检验激活的污泥能承受的负荷。储存污泥激活过程的氮素变化见图2。
2.2.1 启动阶段
在激活过程中，初始进水的NH4+-N和NO2--N为恒定的50mg/L，HRT为1d，温度控制在35℃，反应器pH保持7.8~8。运行15d后成功启动Anammox工艺，之后Anammox菌活性不断提高。
吴凯用普通污泥启动Anammox过程，122d后运行稳定，NH4+-N和NO2--N平均去除率为86.67%、91.65%。金仁村等以反硝化污泥为接种污泥启动Anammox固定床反应器，经86d成功启动。可见储存污泥作为接种污泥大大缩短反应器启动时间，这是由于储存污泥含有一定量Anammox菌，避免了污泥转换和活性迟滞期，启动进程加快。
启动阶段NH4+-N、NO2--N和总氮随时间变化情况如图3所示。
从图3(a)可知，NH4+-N去除速率由18.73mg/(L.d)提升至40.68mg/(L.d)，去除率由37.46%提高到81.36%曰NO2--N去除速率从39.62mg/(L.d)升至49.67mg/(L.d)，去除率由79.24%提高到99.34%。由此可见，常温储存的污泥经过适当的方法激活后，AnAOB在激活初期能表现出较高的活性，对NH4+-N和NO2--N的去除均有一定效果曰随着时间的推移，NH4+-N和NO2--N的去除率逐步提高，AnAOB的活性得到进一步恢复与提升。由图3(b)可见，进水总氮负荷保持在100mg/(L.d)，总氮去除速率和去除率变化趋势相似，在第5天出现轻微波动，可能是由于Anammox活性初期不稳定，但总体来看呈上升趋势。总氮去除速率由初始58.32mg/(L.d)提高到83.37mg/(L.d)，总氮去除率从58.32%提高到83.37%。
g/(L.d)，总氮去除率从58.32%提高到83.37%。亚硝酸盐消耗量(NO2--N)与氨氮消耗量(NH4+-N)之比(R1)、硝酸盐生成量(NO3--N)与氨氮的消耗量(NH4+-N)之比(R2)随时间的变化情况见图4。
A.A.vandeGraff等得出R1、R2的理论值分别为1.32、0.26。从图4可见，实际R1从起初的2.12逐渐变成1.22，第9天时其达到1.33，非常接近理论值1.32，但随着生物活性逐渐恢复，当活性完全恢复时其比值为1.22，略低于理论值，大致接近。I.Tsushima等发现R1为0.8~0.7时反应装置的去除效率较高，而R.C.Jin等认为1.2时处理效果最佳，其他学者也在不同条件下发现最佳比值在1.32上下浮动，大都不等于1.32。从图4还可看出，R2从0缓慢升高至0.17左右，同样低于理论值。R1和R2都低于理论值，可能与反应装置的类型、所处环境条件不同有关，也与反应装置中的菌种结构和状态有联系。
2.2.2 负荷提高阶段
在负荷提高阶段，进水NH4+-N和NO2--N由50mg/L逐步提高，经过70、100、150mg/L，最终提高至200mg/L。此阶段NH4+-N、NO2--N和总氮随时间变化情况如图5所示。
从图5(a)可以看出，NH4+-N去除率在负荷提升阶段有小范围波动，每次进水浓度改变，其去除效果较同期而言较差，然后逐渐恢复，最终趋于稳定，其去除率稳定在83%左右。NO2--N去除率也有类似情况，在小范围内波动。但与前者相比，NO2--N的波动较小，其去除率在稳定时可达99.99%。NH4+-N和NO2--N的平均去除速率分别为121.97、145.47mg/(L.d)，平均去除率分别达到82.17%、98.36%。图5(b)中，总氮去除速率随总氮负荷的阶梯式提高呈阶梯式变化，最大去除速率达341.43mg/(L.d)，总氮去除率上下波动，但总体变化幅度不大，平均为83.90%。
负荷提高阶段R1、R2随时间变化情况见图6。
由图6可见，负荷提高阶段R1有小幅波动，最大值和最小值分别为1.35、1.13，平均值为1.21，与激活阶段的比值大致相等。此实验条件下Anammox反应的化学计量比R1大致为1.21，与理论值非常接近，但仍存在一定差值。进水由50mg/L提高到70mg/L初期，R2呈下降趋势，在第21天出现最小值0.07，随着污泥活性的恢复R2趋于平稳，平均约为0.16，低于理论值0.26。R1和R2的实际值与理论值存在偏差，除与反应装置类型、环境条件等有关外，还可能是由于反应器内AnAOB为优势菌种，存在少量以NO3--N为电子受体的反硝化菌协同脱氮。
有学者认为，在污泥储存过程中添加培养基会使储存后的激活效果更好。吴凯在室温(25℃)下添加培养液(50mg/LNH4+-N和50mg/LNO2--N)，储存30d、激活15d后，NH4+-N和NO2--N去除率分别为76.7%、95.8%。而本研究在常温(20℃)储存Anammox污泥过程中不加营养液，储存1个月的Anammox污泥经15d激活，NH4+-N和NO2--N去除率可达81.36%、99.34%。无培养基条件对常温短时间储存影响不大，且储存后的激活效果可能更好。间歇添加营养液或缓冲液对储存过程可能产生不利影响。
Anammox污泥无基质储存时要考虑温度的影响。较高温度下储存，Anammox菌活性较高，代谢较快，致使生物量很快衰减，增加了其恢复难度，且恢复后的活性不易达到储存前水平，即使是短时间内的储存也很难恢复曰过低的温度则可能导致细胞不可逆的冻伤或破裂，也会使污泥储存后的细胞活性难以恢复。而在适宜温度下短时间储存，可以减缓Anammox菌的衰减，有利于储存后Anammox污泥活性恢复。通过批式实验研究储存污泥的激活，发现-20℃下冷冻储存45d的Anammox污泥虽然仍呈鲜亮的红色，但对NH4+-N基本没有去除作用，且其出水呈浅红色。这表明过低温度的冷冻储存会使一部分厌氧氨氧化菌的细胞破裂，细胞色素进入出水，丧失活性。有研究分别考察了常温、中温、低温下储存1个月后Anammox污泥的活性，发现常温储存污泥的总氮去除率最高。这表明常温条件对1个月的短时间Anammox污泥储存可能更有利。本研究表明，常温(20℃)无基质短时间(1个月)储存可以有效保留相当一部分AnAOB，又能避免低温储存污泥难以激活的问题，且常温储存与低温储存相比能耗大大降低。因此，常温无基质短时间储存的Anammox污泥可作为一种Anammox菌种>
三、结论
(1)常温(20℃)下Anammox污泥在填充蜂窝状填料的广口瓶中储存1个月，储存期间不添加任何外界营养物质，细菌密度从3.635×10 11mL-1减少到3.012×10 11mL-1，AnAOB细胞密度从2.338×10 11mL-1减少到1.223×10 11mL-1，储存前后细菌总数并未减少很多，而Anammox菌的数量减少了近一半，但Anammox菌在细菌中仍有40.60%的较高占比。
(2)在FBR中以储存1个月的Anammox污泥作为接种污泥激活Anammox反应，可使Anammox启动时间变短。与采用普通活性污泥启动的Anammox相比，没有停滞期，启动时间显著缩短。接种储存的Anammox污泥可实现Anammox工艺的快速启动。
(3)激活15d后，进水NH4+-N和NO2--N保持在50mg/L，其去除率分别达到81.36%、99.34%，表明Anammox成功启动。再通过提高进水NH4+-N和NO2--N来提高进水氮负荷，第55天进水NH4+-N和NO2--N均达到200mg/L，其去除率分别达到83.52%、99.99%。化学计量比R1和R2的平均值为1.21、0.16。反应器中Anammox菌为主导菌种，并存在少量反硝化菌强化总氮去除。（>
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